快速蛋白高灵敏度染色试剂盒

 

产品编号	规格	贮存
RTD6401	25次	常温

● 贮存、运输及效期：

常温保存；常温运输；开封后一年有效。

● 产品简介

快速蛋白高灵敏度试剂盒是一种快速简单、可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白分离后染色的试剂盒。本试剂盒也可以用于2D凝胶的染色，并且染色后兼容后续的质谱检测。本试剂盒只需约90分钟内可以完成凝胶的染色。对于BSA蛋白，检测灵敏度可以达到0.3 ng蛋白。

本试剂盒可足够用于25块常规的8×10 cm凝胶的染色。

说明书后附有实验记录表格，方便记录实验步骤。

● 产品组成：

产品编号	产品名称	规格	贮存
RTD6401-1	增敏液(100×)	26 ml	常温
RTD6401-2	染色溶液(100×)	26 ml	常温，避光
RTD6401-3	基本显色液(10×)	250 ml	4℃
RTD6401-4	显色加速液(2000×)	1.5 ml	常温，避光
RTD6401-5	终止液(20×)	125 ml	常温

● 注意事项：

1. 由于该方法染色非常灵敏，操作时请注意尽量使用高纯度的水，并确保所使用的器皿非常清洁，最好使用洁净的玻璃器皿。操作时必须戴手套，避免皮肤和凝胶直接接触。

2. 需自备乙醇、冰醋酸及MilliQ级纯水或双蒸水。

3. 下述使用说明中各种溶液的使用量适用于大小为8×10 cm厚度为0.75-1 mm的凝胶。对于更大的凝胶，各种溶液的使用量需按凝胶面积的比例放大；对于更厚的凝胶，作用时间需按照厚度的比例适当延长10-20分钟。

4. 本说明书所指的常温温为20-25℃，操作温度较低时由于溶液的扩散能力下降，各步骤需适当延长时间。

5. 基本显色液(10×)在4℃低温贮存时可能会出现沉淀，可在37℃水浴中溶解，并充分混匀后使用。

● 使用方法：

一. 固定步骤：

1.1 漂洗：电泳结束后，凝胶中加入100 ml双蒸水中漂洗5分钟，重复漂洗1次，去除凝胶表面的电泳缓冲液。

1.2 固定：取漂洗后的凝胶放入约100 ml固定液中，在摇床上常温摇动20分钟，摇动速度为60-70 rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。

 

固定液的配制 配制量100 ml

无水乙醇	冰醋酸	超纯水
50 ml	10 ml	40 ml

1.3 30%乙醇洗涤：

弃固定液，加入100 ml 30%乙醇，在摇床上常温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。

30%乙醇的配制：

70 ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30 ml乙醇，混匀后即成100 ml 30%乙醇。

1.4 水漂洗：

弃30%乙醇，加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上常温摇动5分钟，摇动速度为60-70 rpm；重复漂洗一次。

二. 增敏步骤：

2.1 弃水，加入100 ml增敏液(1×)，在摇床上常温摇动2分钟，摇动速度为60-70 rpm。

增敏液(1×)的配制：

增敏液(100×)	超纯水
1 ml	99 ml

注：增敏液(1×)配制后需在2小时内使用。

2.2 水漂洗(共2次)：

弃原有溶液，加入200 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上常温摇动1分钟，摇动速度为60-70 rpm。 重复此步骤一次。

三. 染色步骤：

3.1 染色：

弃水，加入100 ml染色溶液(1×)，在摇床上常温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。 染色过程中，凝胶会呈微微黄色。

染色溶液(1X)的配制：

染色液(100×)	超纯水
1 ml	99 ml

注：染色溶液(1X)配制后需在2小时内使用。

3.2 水洗涤：

弃染色溶液，加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上常温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm。

注意：水洗涤的时间不能超过1.5分钟。

四. 显色步骤：

弃水，加入100 ml显色液，在摇床上常温摇动3-7分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70 rpm。

显色液的配制 配制量100 ml

基本显色液(10×)	超纯水	显色加速液(2000×)
10 ml	90 ml	50 μl

注：显色加速液(2000×)有刺激性气味，建议在通风橱内操作；

显色液配制后需在20分钟内使用。

五. 终止步骤：

5.1 漂洗：弃显色液，加入100 ml双蒸水在摇床上常温摇动2分钟，漂洗掉凝胶上残留的显色液。

5.2 终止染色：

弃显色液，加入100 ml终止液(1×)，在摇床上常温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。

终止液(1×)的配制：

终止液(20×)	超纯水
5 ml	95 ml

注：终止液(1×)配制后应当天使用。

5.3 水洗涤：

弃终止液，加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上常温摇动5分钟，摇动速度为60-70 rpm。

六. 保存：

可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存或采用适当的方式制备成干胶。

● 常见问题：

一.  背景太深：

1.1. 步骤四显色时间过长。通常显色反应会在10分钟内结束，显色反应时间过长会导致背景很深。

1.2. 洗涤不充分。洗涤时间过短，或洗涤液加入的量不足，或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合，或摇动速度过慢，导致混匀不充分。请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间，摇床的推荐速度为60-70 rpm。

1.3 步骤1.2中凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。一方面需确保固定的时间和固定液的用量，另一方面对于不是最常用的Bis-Tris系统的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分，以降低背景。

1.4 水的纯度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高纯度水。

二.  蛋白条带非常浅：

2.1 蛋白的半胱氨酸(Cysteine)残基的含量特别低或几乎没有。半胱氨酸残基的存在对于染色非常重要，半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。

2.2 步骤3.2染色后水洗涤时间过长。在染色溶液染色时需严格控制水洗涤的时间，水洗涤的时间不能超过1.5分钟，否则会导致过多的显色离子被洗去，导致检测灵敏度下降。

2.3 上样量不足。本试剂盒检测BSA的灵敏度可以达到0.3 ng，对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。对于一些蛋白可能需要大于1 ng的蛋白量才能被检测到。

2.4步骤1.3和1.4的洗涤不够充分。导致少量乙酸残留，影响后续检测。确保30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间，可以适当延长洗涤时间。

三.  凝胶上出现小点或其它非蛋白的痕迹：

3.1 凝胶没有充分被溶液浸没。请注意选择大小合适的容器，并加入足量的各种溶液，同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。

3.2 用于染色的容器没有充分洗涤干净。容器需先用洗涤剂充分洗涤，随后用自来水充分冲洗，最后用高纯度水再洗涤数次。该容器最好能专用于染色，并注意避免各种可能的蛋白污染。

3.3 指纹或其它压痕。请注意戴手套操作，切勿直接接触皮肤。操作时请注意尽量勿挤压、

折叠或摩擦凝胶。

3.4 有金属物质接触凝胶。金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。

四.  在60-70 kD处出现一片模糊的蛋白染色背景：

皮肤上脱落的角蛋白(keratin)污染了蛋白样品。一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开，甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。

五. 在凝胶的上半部分出现黄色背景：

5.1 样品使用了含有DTT的上样缓冲液。换用含有其它还原试剂如β-巯基乙醇的上样缓冲液。

5.2 采用Tris-Glycine-SDS电泳体系。Tris-Glycine-SDS电泳体系中的Glycine会导致

背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。

● 实验记录表格

实验日期：

		约90分钟	标记√	起始时间
一 固定步骤
	1.1 水漂洗	2×5 min
	1.2 固定	20 min
	1.3 乙醇漂洗	10 min
	1.4水漂洗	2×5 min
二 增敏步骤
	2.1 增敏	2 min
	2.2 水漂洗	2×1 min
三 染色步骤
	3.1染色	10 min
	3.2水漂洗	＜1.5 min
四 显色步骤
	显色	3-7 min
五 终止步骤
	5.1 水漂洗	2 min
	5.2 终止	10 min
	5.3 水漂洗	5 min
六 保存

实验示例：