碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒    

Basic Protein Native PAGE Gel Preparation and Electrophoresis Kit

 

货号	名称	规格
RTD6131	碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒	50次

 

● 产品组成：

序号	货号	名称	规格	保存条件
1	AC2913-01	30%PAA(29:1)	100 ml	4℃，避光
2	RTD6131-02	4×碱性蛋白分离胶缓冲液 pH4.3	100 ml	4℃
3	RTD6131-03	4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液 pH6.8	50 ml	4℃
4	RTD6131-04	100×分离胶促凝剂	2.5 ml	-20℃
5	AP020P	APS（干粉）	5 ml	RT
6	TA0761-01	TEMED	0.5 ml	4℃，避光
7	PL110	5×甲基绿上样缓冲液	1 ml	-20℃
8	TG160P	5×碱性蛋白电泳缓冲液（干粉）	1 L	RT

● 产品简介：

本公司提供的试剂盒包含碱性蛋白凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水。本试剂盒可用于配制碱性蛋白非变性(native)PAGE凝胶。本试剂盒可配制30-50块常规大小的非变性PAGE胶。

各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质称为碱性蛋白质，等电点偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性。分离碱性蛋白时候，要利用低 pH 凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高 pH 凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的 pH 是 8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。

特别说明：

1. 由于本系统采用非连续凝胶系统，分离胶pH为4.3，因此要求待分离的蛋白等电点pI＞7.0，这样碱性蛋白在酸性凝胶系统内带正电荷，在凝胶电泳中才能正常向阴极泳动。如果待分离的蛋白等电点pI＜7.0，请选择非连续Laemmli活性凝胶系统分离（货号：RTD6130）。

2. 本试剂盒不适用于总蛋白样品的电泳，也不适用于总蛋白分离后的Wstern Blot检测；推荐应用于纯化后蛋白的碱性蛋白电泳。

● 保存及运输：

   按照标签温度贮存；常温运输；开封后一年有效。

● 使用说明：

一 配制分离胶

根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度（表一），配制非变性PAGE的分离胶。

表一 不同浓度的PAGE分离胶的最佳分离范围

PAGE分离胶浓度	最佳分离范围
6%	50-150kD
8%	30-90kD
10%	20-80kD
12%	12-60kD
15%	10-40kD

配制分离胶前，根据以下配方准备10% APS：

10% APS配制-5 ml：

将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。

制备分离胶步骤：

1．根据下表，将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡

2．在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。

3．静置15-30分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

表二 配制不同浓度分离胶所需各组分的体积(毫升)

组份	6% 分离胶 5 ml	8% 分离胶 5 ml	10% 分离胶 5 ml	12% 分离胶 5 ml	15% 分离胶 5 ml
灭菌水	2.7	2.4	2	1.7	1.2
4×分离胶缓冲液 pH4.3	1.25	1.25	1.25	1.25	1.25
30％ PAA（29:1）	1	1.3	1.7	2	2.5
100×分离胶促凝剂	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
TEMED	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
10％ APS	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05

二 浓缩胶制备：

1．去除覆盖在分离胶上的水层。

2．按照表三将不同成分在一个小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

3．将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

4．将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

5．静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

表三 碱性蛋白Native PAGE浓缩胶(5%)配方表

组份	5%浓缩胶（2 ml）
H2O	1.15
4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液 pH6.8	0.5
30％ PAA（29:1）	0.33
TEMED	0.002
10％ APS	0.02

 

 

 

 

三 电泳：

凝胶凝固好后，根据以下配方准备电泳缓冲液。

5×碱性蛋白电泳缓冲液的配制-1 L：将5×碱性蛋白电泳缓冲液干粉全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，加入冰醋酸11ml，用水定容至1 L，即配成5×碱性蛋白电泳缓冲液（此溶液pH值约为4.4）。

将5×碱性蛋白电泳缓冲液稀释5倍即配成1×碱性蛋白电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×碱性蛋白电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×碱性蛋白电泳缓冲液。上样，把电泳电源的电源线互换，即红色的阳极电极查到阴极孔，黑色的阴极电极插到阳极孔，按照表四条件，电泳，等指示前沿甲基绿电泳到分离胶下缘后，结束电泳，染色或者进行下一步实验。   

表四 碱性蛋白电泳条件

恒电压	150V
起始电流	30-40mA/板胶
结束电流	10-20mA/板胶
电泳时间	40-45分钟

实验示例：