柱式动物总蛋白提取试剂盒（细胞样品，变性提取） 

Column Animal Cells Denaturing Total Protein Extraction Kit Ver.740164

货号	产品名称	规格
RTD8302	柱式动物总蛋白提取试剂盒（细胞样品，变性提取）	50次

● 产品包装：

货号	组份	规格	贮存
RTD8302-01	变性裂解缓冲液	25 ml	4℃
CD-50	离心柱套装 （包含离心柱和2 ml连盖收集管）	50套	RT

● 产品简介：

本试剂盒可从动物悬浮细胞或贴壁细胞中提取总蛋白，用变性裂解缓冲液配合离心柱裂解细胞，无需超声处理打断DNA，提取过程简便高效，大约10分钟即可完成蛋白提取，可以提取到细胞内的绝大多数蛋白质（包括膜，细胞器，核，核基质和胞质蛋白）。获得的总蛋白可用于SDS-PAGE Western Blot检测、免疫沉淀（IP）等后续研究。由于裂解缓冲液中含有SDS等强变性剂，不建议用于免疫共沉淀（Co-IP）、EMSA以及酶活性分析等与蛋白活性相关的实验。

本产品提取的是细胞样品的变性总蛋白，包括质膜，细胞器，细胞核，核基质和细胞质内的蛋白，提取的蛋白不适用非变性电泳。

按照每次使用~5×106培养细胞加0.5 ml裂解缓冲液计算，本试剂盒大约可以使用50 次。

● 保存、效期及运输：

按照标签温度贮存；有效期一年；试剂盒常温运输。

● 用前必读：

1. 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），需要离心机转速能达到16000 g（约20000 rpm），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。

2. 变性裂解缓冲液混匀后放置于冰上。将离心柱套装盖好管盖，放置于冰上预冷。

3. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在裂解缓冲液中（添加时按照1:100添加，即1 ml裂解缓冲液 添加10 μl抑制剂）；研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。

4. 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）。

● 使用说明：

一. 准备即用型裂解缓冲液：

取适当体积的预冷裂解缓冲液，在使用前数分钟内加入1/100体积的蛋白酶抑制剂（100×）（自备，试剂盒不提供），如果进行蛋白磷酸化研究，需要加入1/100体积的磷酸酶抑制剂

（100×）（自备，试剂盒不提供），随后立即放于冰上待用。

二. 贴壁细胞蛋白提取：

2.1 将预冷的 1×PBS直接加入培养板，培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞，吸去上清。

2. 2 按照下表中将相应体积的变性裂解缓冲液均匀的加入整个器皿表面，用移液器吹打混匀，冰浴5分钟。

细胞类型	培养器皿	细胞数量	细胞沉淀体积（PCV）（μl）	裂解缓冲液（μl）
贴壁细胞	24孔板	~5×105	~5	50
	6孔板	~2.5×106	~25	200
	25cm2培养瓶	~2×106	~20	200
	75cm2培养瓶	~8×106	~80	500
	35 mm培养皿	~2×106	~20	200
	60 mm培养皿	~5×106	~50	500
	100 mm培养皿	~1.5×107	调整细胞数目到2-5×106	200

注： (二百万，2×106)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

2. 3 将裂解的细胞转移到预冷的离心柱中，4℃ 16000g 离心 1分钟。

注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如移液器不易吸取，可以将吸头剪尖，保证将全部裂解物加到离心柱中。

2. 4 弃去离心柱，将收集管中蛋白溶液转移至干净的 1.5 ml 离心管中，即可用于蛋白浓度测定和后续实验。注：如果收集管中有少许沉淀，只需收集上清即可。

三. 悬浮细胞蛋白提取：

3.1 400 g 4℃ 离心5 min收集细胞；用1 ml 1×PBS重悬细胞，400 g 4℃ 离心5 min收集细胞；重复漂洗细胞一次；留下细胞沉淀备用。

3.2 按照下表加入相应体积的变性裂解缓冲液，用移液器重悬，冰浴处理5分钟。

细胞类型	细胞数量	细胞沉淀体积（PCV）（μl）	裂解缓冲液（μl
悬浮细胞	~1×106	~10	100
	~2×106	~20	200
	~5-10×106	＞50	500

注： (二百万，2×106)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

3. 3 将裂解的细胞转移到预冷的离心柱中，4℃ 16000g 离心 1分钟。

注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如移液器不易吸取，可以将吸头剪尖，保证将全部裂解物加到离心柱中。

3. 4 弃去离心柱，将收集管中蛋白溶液转移至干净的 1.5 ml 离心管中，即可用于蛋白浓度测定和后续实验。注：如果收集管中有少许沉淀，只需收集上清即可。