4-18%梯度凝胶配制试剂盒

货号	名称	规格
RTD6161	4-18%梯度胶配制试剂盒	80次

●  货品内容：

组份	货号	名称	规格	保存
1	RTD6161-01	低浓度聚合溶液	250 ml	4℃
2	RTD6161-02	高浓度聚合溶液	250 ml	4℃
3	RTD6161-03	凝胶缓冲液（2×）	2×250 ml	4℃
4	RTD6161-04	改良型促凝剂	10 ml	4℃，配制后-20℃贮存
		说明书	一份

● 产品简介：

该产品利用聚丙烯酰胺凝胶电泳原理，采用合理设计的预混合配方和配制流程，配合梯度凝胶生成系统（货号：RT-GZY02），可以配制得到高质量的4-18%聚丙烯酰胺梯度凝胶。

本试剂盒大约可以配制常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定： 1 mm厚度凝胶可以配制约80-85块胶。

凝胶缓冲液采用中性pH值，配制好的凝胶4℃可以稳定贮存一年。

● 运输和贮存：

本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。

● 特点：

1. 安全：不用接触有毒粉末；不用单独添加有气味的TEMED；

2. 兼容性广：制胶溶液中不含SDS，可用于非变性电泳（Native-PAGE）；

3. 稳定性好：凝胶缓冲液为中性pH，制备好的凝胶可以4℃稳定贮存一年。

● 使用说明：

一  凝胶制备：

1.1参照梯度混合仪设备（货号：RT-GZY02）说明书，准备仪器，按照图示将系统连接：

将带接头的硅胶管一端插入到梯度混合仪侧方插口（可以选择连接蓝色阀门），另一端与蠕动泵下方硅胶管接头连接（蠕动泵溶液方向是一般为下进上出）。蓝色阀门插入到多板制胶器接口，将不带接头硅胶管截取适当长度一端与蓝色阀门连接，另一端与蠕动泵上方硅胶管接头连接。蓝色阀门旋钮方向与硅胶管平行为开启，旋转至与硅胶管垂直方向为关闭。梯度混合仪左侧杆状旋钮与地面垂直为开启，旋转与水平面有夹角为关闭。

1.2 蠕动泵使用方法：

按照图示调节蠕动泵。灌装速度不要太快。

 

1.3 多板制胶器使用：

使用前将多板制胶器填充块两侧的保护膜揭掉；

准备好制胶用的厚玻璃板和短玻璃板。

将厚玻璃板和短玻璃板对齐并在短玻璃板前方放一张分隔片，此为一套玻板三明治组合；

将多板制胶器放倒，以厚玻板在下的方式放入玻板三明治组合，1.0厚度玻璃板最多可放12套；

插入密封挡板，在最后一块填充块或者最后一组玻板组合前插入适量的分隔片以保证玻板和填充块压紧，然后拧紧螺丝。

在密封挡板下面小孔插入阀门，并打开阀门（阀门旋钮与硅胶管平行为开启）。

1.4 配制溶液：

按照下表配制溶液，以制备12板 4-18% 厚度1.0mm梯度胶为例：

		左槽 18%	右槽 4%
货号	名称	总体积70 ml	总体积70 ml
RTD6161-01	低浓度聚合溶液	-	35 ml
RTD6161-02	高浓度聚合溶液	35 ml	-
RTD6161-03	凝胶缓冲液（2×）	35 ml	35 ml
RTD6161-04	改良型促凝剂	18 μl	高于25℃	20-30 μl
			低于25℃	35 μl

梯度混合仪加入溶液前，首先把梯度混合仪阀门关闭（旋转旋钮与水平面有夹角为关闭）。

加入溶液原则：左槽（靠近旋钮阀门）加高浓度溶液；右槽（靠近出口）加低浓度溶液。

将磁力搅拌子放入右槽中，打开磁力搅拌器（自备），转动转子。

1.5 灌胶操作：

重要步骤：

灌胶前事先检查: 梯度混合仪旋钮是否为开启状态(杆状旋钮与水平面垂直为开启):应为开启

磁力搅拌子是否转动：应为转动

蠕动泵是否为关闭状态：应为关闭

多板制胶器阀门是否为开启状态(蓝色旋钮与硅胶管平行为开启):应为开启

检查无误后，打开蠕动泵，使用a模式，调节数字为25，开始灌胶操作。至多板制胶器中的溶液至顶部接近溢出时，首先关闭多板制胶器蓝色阀门（旋钮与硅胶管垂直为关闭）；

暂停蠕动泵；迅速在梯度混合仪左右槽中加满蒸馏水，打开蠕动泵，彻底冲洗管道。

注：此步骤非常重要，不立即彻底冲洗，残余的凝胶会堵塞梯度混合仪和管道。

仔细插入梳子，尽量一次成功，避免产生气泡。

37℃ 恒温箱中凝固2-3小时。

注：凝固温度非常关键，当室内温度低于18度时，凝固时间会很长。

1.6 拆胶：

待凝胶凝固好后，打开多板制胶器螺丝，用胶铲在两板之间轻轻撬动，注意不要误撬玻璃短板，否则将导致玻璃板和胶之间产生气泡，使得凝胶无法使用。用水将每板凝胶冲洗干净，自封袋封好，加入2 ml  1×电泳缓冲液保持润湿，4℃水平放置。

二  电泳：

2.1 SDS-PAGE变性电泳：

2.1.1电泳缓冲液配制：

将5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。

2.1.2 样品处理：融化-混合-变性-上样

5×MonoColor蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl 5×上样缓冲液；将蛋白样品置于95℃中加热5-10分钟；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。

2.1.3 电泳过程；

在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。

表三 SDS-PAGE电泳条件

恒电压	起始电流（一板胶）	结束电流（一板胶）	电泳时间	适用条件
150V	35-40 mA	15-20 mA	55 + min	最佳电压，最优的分辨率
200V	45-55 mA	20-25 mA	45+ min	节省时间
225V	40-50 mA	15-20 mA	35+ min
250V	65-75 mA	20-25 mA	30+ min
300V	70-80 mA	25-35mA	25+ min	最省时间

2.2 非变性电泳（Native PAGE）：

2.2.1电泳缓冲液配制：

将5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。

2.2.2 样品处理：融化-混合-上样

5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl 5×上样缓冲液；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。注：非变性电泳样品不能加热处理。

2.2.3 电泳过程；

在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

表四 Native PAGE电泳条件

	恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间	适用条件
推荐电压	150V	25-35/板胶	5-10 mA/板胶	60 + min	最佳电压，最优的分辨率

三. 染色：

1. 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。

2. 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。

3. 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。

4. 观察保存结果。